測序技術在環境微生物方面研究與應用的新進展

副標題：【老王聊生物】九九歸一計劃·石頭漫談VOL.020

本文作者「過期石頭」特約撰稿人：生物老王

前言

大家好呀！我是時不時斷更（劃掉）更新的石頭呀！今天石頭請來一位學習生物的帶佬“老王”先森爲大家講一些生物學有關的研究，這將是“老王聊生物”的第一期，希望大家喜歡，同時也希望各位小夥伴能有所收穫！

引言

目前，環境污染問題迫在眉睫，物理、化學等修復技術並不能有效改善環境問題。爲了更好的解決環境污染問題，相關人士經大量研究發現利用環境微生物的降解、代謝或富集等獨特的生物修復功能，能夠改善、優化被污染的環境，使環境得到再生[1]。

環境微生物(Environmental microorganism)通常是指大量的、極其多樣的存在於自然界的—大羣體形微小、結構簡單、肉眼直接看不見，必須藉助光學顯微鏡或電子顯微鏡放大數百倍、數千倍，甚至數萬倍才能觀察到的微小生物。其羣落結構及其多樣性是環境科學的重點研究內容 [2]，傳統的研究微生物羣落結構及其與環境關係的方法則是以分離純菌培養爲主 [3]，這種微生物純培養及顯微技術作爲鑑定微生物種羣的手段有很大的侷限性，因爲環境中大多數微生物處於“存活但不能培養 ”的狀態[4]。因此，培養技術的不足使得超過99%的原核微生物無法在實驗室培養得到, 導致微生物結構和功能多樣性的研究一直髮展緩慢[5]。隨後變性凝膠梯度電泳(denatured gradient gel electrophoresis, DGGE)技術、聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis. PCR-DGGE)等分子生物學技術雖能夠繞開分離和培養步驟[6]。但受到樣品大小、採集等因素的影響，且許多微生物需在分離培養後才能透徹地對其研究，這導致僅有1％~10％的環境微生物可以進行分析，依舊阻礙了環境微生物羣落結構及多樣性的深入研究[7]。

20世紀90年代以Sanger法 (雙脫氧核苷酸末端終止法)爲代表的第1代測序技術幫助人們完成了完成了迄今爲止世界上最大的生物協作項目：人類基因組計劃，但由於其成本高、速度慢、通量低等不足，已不能滿足後基因組時代的測序要求[8]。21世紀，第二代測序技術（second generationse quenching,NGS）以及第三代測序技術(third denerationse quenching,TGS)相繼問世，能夠克服上述分子生物學技術的缺點，且第三代測序技術就有超長的測序讀長、無GC鹼基偏好性和速度快等優勢 [3]使得人們能更好進一步研究環境微生物羣落結構等領域。目前微生物多樣性研究中以第二代測序爲主，而基因組測序以及環境總基因測序以第三代測序爲主[9]。

據此，爲了更全面地瞭解測序技術在環境微生物方面的研究與應用的最新進展，從典型環境介質出發，結合最新成果和課題組研究進展，對測序技術在海洋微生物多樣性[10]、污水生物處理[11]以及土壤功能微生物[12]等方面的應用進行總結，以期爲環境微生物領域的嶄新研究提供理論指導。

DNA測序鑑定微生物多樣性的原理

目前測序技術主要通過標記基因或全基因組測序研究環境微生物多樣性。原核生物和真核生物的基因組都含有保守區和可變區，其中保守區反映了物種間的親緣關係，而可變區能夠反映物種之間的差異，適用於進行測序和分類鑑定。DNA測序即是分析其特定可變區（可選擇單可變區或多可變區）進行PCR擴增，再結合高通量測序和生物信息分析（採用RDP classifier貝葉斯算法對97 %相似水平的OTU代表序列進行分類學分析,基因序列一致性大於97%的微生物粗略估計爲同一物種[12]），進行大規模微生物羣落組成的鑑定，表達丰度。該方法無需分離培養細菌，實驗操作簡單，並可大規模鑑定特定生境中全部菌羣而成爲研究環境樣品中微生物物種羣落的重要手段。

基於豐富的數據庫，DNA測序配合專門開發的數據分析程序可以將菌羣鑑定到“種”，杭州聯川生物技術股份有限公司則將菌羣多樣性鑑定率先精細到“種”，使得微生物分類更明確。

測序技術在水環境微生物方面的應用

微生物是指示水生態環境變化的敏感指標[13]。而對於生活在水中的個體較小的細胞，難以依靠光學根據細胞的形態結構特徵確定其種類。但基於DNA多樣性的高通量測序技術則可以在水環境下對微生物進行測序，爲水環境變化提供參考依據。

景明[14]針對張家港某河道水色異常事件，採用高通量測序技術對18S rRNA基因V4區測序，結果顯示數量較多且羣落組成單一， Pedospumella encystans佔93.94%。用高通量測序技術對16S rRNA基因V4區測序，結果顯示數量相對較少且羣落分佈較爲均勻，同時結合顯微鏡鑑定結果判斷引起河道生態污染的微生物爲一體積較小的真核浮游藻類Pedospumella encystans。

測序技術在土壤微生物方面的應用

土壤微生物作爲土壤生態系統的重要組成部分，在土壤有機質分解、植物營養供給以及腐殖質形成過程中起着至關重要的作用[15]。當環境發生變化時，微生物的活動強度甚至羣落組成都會產生相應地變化以適應新的環境。因此，可以用微生物羣落的數量及組成結構來監測土壤環境的變化及生態系統恢復效果。

陳影[16]爲明確遼河保護區河岸帶生物多樣性恢復現狀以促進河岸帶生態系統的健康管理，通過對土壤微生物高通量測序分析。在遼河干流的23個採樣點河岸帶土壤中微生物多樣性呈波動性變化，不同微生物羣落受環境因素影響存在顯著性差異。據此可爲遼河保護區河岸帶恢復提供理論依據。候磊[17]等利用高通量測序技術對藏北高寒草甸土壤線蟲的羣落組成進行分析，討論增溫對土壤線蟲羣落的影響，有助於理解線蟲羣落對增溫的適應過程，增強對氣候變暖影響的認識，爲藏北高寒草甸的管理維護提供借鑑。

測序技術在氣體微生物中的應用

空氣中廣泛分佈的細菌、真菌孢子、放線菌和病毒等微生物粒子與空氣環境質量以及人類健康等密切相關，小部分具有活性的生物粒子能夠導致各種微生物疾病的發生[18]。由生物粒子組成的氣溶膠，是大氣的重要組成部分，並可通過直接散射或吸收太陽能輻射在全球氣候變化中起着至關重要的作用[19]。

河南新鄉受獨特的盆地地形影響，大氣污染物向外擴散能力差，是我國霧霾污染較嚴重的地區，因此容易引發中、重度污染。特別是在冬季,隨着北方供暖季的到來,煤炭使用量急劇增大,更加劇了霧霾的嚴重程度。楊清香[20]等採集新鄉市冬季嚴重霧霾天氣下校園室外環境和醫院門診大廳的大氣顆粒物樣本,通過培養法和分子生物學技術研究了氣傳細菌和真菌的丰度與羣落組成。結果顯示，霧霾發生時校園室外環境中空氣微生物的濃度高於醫院室內環境，這與醫院大廳內環境相對封閉,以及定期消毒殺菌有關。值得注意的是,不論是培養法還是SMRT測序，都檢測出丰度較高的條件致病菌和致敏真菌且空氣微生物的濃度均遠高於這一標準（根據美國疾病控制預防中心調查，空氣中游離菌數>500cfu/m3 時,就有發生感染的危險性）,說明霧霾天氣下空氣中的微生物具有危害人類健康的風險。

結束語

微生物調控的生物地球化學過程影響生態系統功能微生物與生態因子的相互作用是必不可少的。隨着測序技術的突飛猛進，各種測序儀相繼問世促進了對環境微生物的研究，但不同的方法有其固有的侷限性。方法的選擇和應用應根據具體的研究情況而定。

目前微生物多樣性研究中以第二代測序爲主，而基因組測序以及環境總基因測序以第三代測序爲主。但隨着測序技術的創新發展，第三代測序技術必將成爲主流。而SMRT測序技術在環境微生物研究領域應用最成熟且最多的還是微生物全基因組測序，在複雜環境微生物宏基因組研究中還存在諸多問題需要解決，已有的研究也只是淺嘗輒止。在我們文獻查閱的範圍之內，還沒有發現真正將 SMRT測序技術應用於複雜環境微生物研究。因此，這方面還需要進一步探索。

參考文獻
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