测序技术在环境微生物方面研究与应用的新进展

副标题：【老王聊生物】九九归一计划·石头漫谈VOL.020

本文作者「过期石头」特约撰稿人：生物老王

前言

大家好呀！我是时不时断更（划掉）更新的石头呀！今天石头请来一位学习生物的带佬“老王”先森为大家讲一些生物学有关的研究，这将是“老王聊生物”的第一期，希望大家喜欢，同时也希望各位小伙伴能有所收获！

引言

目前，环境污染问题迫在眉睫，物理、化学等修复技术并不能有效改善环境问题。为了更好的解决环境污染问题，相关人士经大量研究发现利用环境微生物的降解、代谢或富集等独特的生物修复功能，能够改善、优化被污染的环境，使环境得到再生[1]。

环境微生物(Environmental microorganism)通常是指大量的、极其多样的存在于自然界的—大群体形微小、结构简单、肉眼直接看不见，必须借助光学显微镜或电子显微镜放大数百倍、数千倍，甚至数万倍才能观察到的微小生物。其群落结构及其多样性是环境科学的重点研究内容 [2]，传统的研究微生物群落结构及其与环境关系的方法则是以分离纯菌培养为主 [3]，这种微生物纯培养及显微技术作为鉴定微生物种群的手段有很大的局限性，因为环境中大多数微生物处于“存活但不能培养 ”的状态[4]。因此，培养技术的不足使得超过99%的原核微生物无法在实验室培养得到, 导致微生物结构和功能多样性的研究一直发展缓慢[5]。随后变性凝胶梯度电泳(denatured gradient gel electrophoresis, DGGE)技术、聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis. PCR-DGGE)等分子生物学技术虽能够绕开分离和培养步骤[6]。但受到样品大小、采集等因素的影响，且许多微生物需在分离培养后才能透彻地对其研究，这导致仅有1％~10％的环境微生物可以进行分析，依旧阻碍了环境微生物群落结构及多样性的深入研究[7]。

20世纪90年代以Sanger法 (双脱氧核苷酸末端终止法)为代表的第1代测序技术帮助人们完成了完成了迄今为止世界上最大的生物协作项目：人类基因组计划，但由于其成本高、速度慢、通量低等不足，已不能满足后基因组时代的测序要求[8]。21世纪，第二代测序技术（second generationse quenching,NGS）以及第三代测序技术(third denerationse quenching,TGS)相继问世，能够克服上述分子生物学技术的缺点，且第三代测序技术就有超长的测序读长、无GC碱基偏好性和速度快等优势 [3]使得人们能更好进一步研究环境微生物群落结构等领域。目前微生物多样性研究中以第二代测序为主，而基因组测序以及环境总基因测序以第三代测序为主[9]。

据此，为了更全面地了解测序技术在环境微生物方面的研究与应用的最新进展，从典型环境介质出发，结合最新成果和课题组研究进展，对测序技术在海洋微生物多样性[10]、污水生物处理[11]以及土壤功能微生物[12]等方面的应用进行总结，以期为环境微生物领域的崭新研究提供理论指导。

DNA测序鉴定微生物多样性的原理

目前测序技术主要通过标记基因或全基因组测序研究环境微生物多样性。原核生物和真核生物的基因组都含有保守区和可变区，其中保守区反映了物种间的亲缘关系，而可变区能够反映物种之间的差异，适用于进行测序和分类鉴定。DNA测序即是分析其特定可变区（可选择单可变区或多可变区）进行PCR扩增，再结合高通量测序和生物信息分析（采用RDP classifier贝叶斯算法对97 %相似水平的OTU代表序列进行分类学分析,基因序列一致性大于97%的微生物粗略估计为同一物种[12]），进行大规模微生物群落组成的鉴定，表达丰度。该方法无需分离培养细菌，实验操作简单，并可大规模鉴定特定生境中全部菌群而成为研究环境样品中微生物物种群落的重要手段。

基于丰富的数据库，DNA测序配合专门开发的数据分析程序可以将菌群鉴定到“种”，杭州联川生物技术股份有限公司则将菌群多样性鉴定率先精细到“种”，使得微生物分类更明确。

测序技术在水环境微生物方面的应用

微生物是指示水生态环境变化的敏感指标[13]。而对于生活在水中的个体较小的细胞，难以依靠光学根据细胞的形态结构特征确定其种类。但基于DNA多样性的高通量测序技术则可以在水环境下对微生物进行测序，为水环境变化提供参考依据。

景明[14]针对张家港某河道水色异常事件，采用高通量测序技术对18S rRNA基因V4区测序，结果显示数量较多且群落组成单一， Pedospumella encystans占93.94%。用高通量测序技术对16S rRNA基因V4区测序，结果显示数量相对较少且群落分布较为均匀，同时结合显微镜鉴定结果判断引起河道生态污染的微生物为一体积较小的真核浮游藻类Pedospumella encystans。

测序技术在土壤微生物方面的应用

土壤微生物作为土壤生态系统的重要组成部分，在土壤有机质分解、植物营养供给以及腐殖质形成过程中起着至关重要的作用[15]。当环境发生变化时，微生物的活动强度甚至群落组成都会产生相应地变化以适应新的环境。因此，可以用微生物群落的数量及组成结构来监测土壤环境的变化及生态系统恢复效果。

陈影[16]为明确辽河保护区河岸带生物多样性恢复现状以促进河岸带生态系统的健康管理，通过对土壤微生物高通量测序分析。在辽河干流的23个采样点河岸带土壤中微生物多样性呈波动性变化，不同微生物群落受环境因素影响存在显著性差异。据此可为辽河保护区河岸带恢复提供理论依据。候磊[17]等利用高通量测序技术对藏北高寒草甸土壤线虫的群落组成进行分析，讨论增温对土壤线虫群落的影响，有助于理解线虫群落对增温的适应过程，增强对气候变暖影响的认识，为藏北高寒草甸的管理维护提供借鉴。

测序技术在气体微生物中的应用

空气中广泛分布的细菌、真菌孢子、放线菌和病毒等微生物粒子与空气环境质量以及人类健康等密切相关，小部分具有活性的生物粒子能够导致各种微生物疾病的发生[18]。由生物粒子组成的气溶胶，是大气的重要组成部分，并可通过直接散射或吸收太阳能辐射在全球气候变化中起着至关重要的作用[19]。

河南新乡受独特的盆地地形影响，大气污染物向外扩散能力差，是我国雾霾污染较严重的地区，因此容易引发中、重度污染。特别是在冬季,随着北方供暖季的到来,煤炭使用量急剧增大,更加剧了雾霾的严重程度。杨清香[20]等采集新乡市冬季严重雾霾天气下校园室外环境和医院门诊大厅的大气颗粒物样本,通过培养法和分子生物学技术研究了气传细菌和真菌的丰度与群落组成。结果显示，雾霾发生时校园室外环境中空气微生物的浓度高于医院室内环境，这与医院大厅内环境相对封闭,以及定期消毒杀菌有关。值得注意的是,不论是培养法还是SMRT测序，都检测出丰度较高的条件致病菌和致敏真菌且空气微生物的浓度均远高于这一标准（根据美国疾病控制预防中心调查，空气中游离菌数>500cfu/m3 时,就有发生感染的危险性）,说明雾霾天气下空气中的微生物具有危害人类健康的风险。

结束语

微生物调控的生物地球化学过程影响生态系统功能微生物与生态因子的相互作用是必不可少的。随着测序技术的突飞猛进，各种测序仪相继问世促进了对环境微生物的研究，但不同的方法有其固有的局限性。方法的选择和应用应根据具体的研究情况而定。

目前微生物多样性研究中以第二代测序为主，而基因组测序以及环境总基因测序以第三代测序为主。但随着测序技术的创新发展，第三代测序技术必将成为主流。而SMRT测序技术在环境微生物研究领域应用最成熟且最多的还是微生物全基因组测序，在复杂环境微生物宏基因组研究中还存在诸多问题需要解决，已有的研究也只是浅尝辄止。在我们文献查阅的范围之内，还没有发现真正将 SMRT测序技术应用于复杂环境微生物研究。因此，这方面还需要进一步探索。

参考文献
[1] 徐娟,吴坚,陈建红.微生物在环境工程中的应用研究[J].皮革制作与环保科技,2021,2(2):56-58.
[2] 李晓然，吕毅，宫路路，等．微生物分子生态学发展历史及研究现状［Ｊ］．中国微生物学杂志2012,24(4) :366-369．
[3] 艾铄,张丽杰,肖芃颖,张晓凤,邢志林.高通量测序技术在环境微生物领域的应用与进展[J].重庆理工大学学报：自然科学,2018,32(9):111-121.
[4] 段曌,肖炜,王永霞,赖泳红,崔晓龙.454测序技术在微生物生态学研究中的应用[J].微生物学杂志,2011,31(05):76-81.
[5] 许亚昆,马越,胡小茜,王军.基于三代测序技术的微生物组学研究进展[J].生物多样性,2019(5):534-542.
[6] 杜贞娜,程斐,单之初,郭怀宇,孙剑秋,臧威.高通量测序技术及其在黄酒微生物多样性研究中的应用[J].中国酿造,2021,40(8):14-19.
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[8] 张子敬,刘燕蓉,张顺进,贺花,李佳霄,刘贤,吕世杰,李志明,王二耀,雷初朝,黄永震.第三代测序技术的方法原理及其在生物领域的应用[J].中国畜牧杂志,2020,56(6):11-15.
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[11] 承中雪.高通量测序技术在水环境微生物群落多样性中的应用[J].环境与发展,2018,30(7):95-95+97.
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[16] 陈影,陈苏,马鸿岳,单岳,冯天朕,张鸿龄.辽河干流河岸带植物及微生物多样性研究[J].农业环境科学学报,2020,39(09):2048-2057.
[17] 侯磊,薛蓓,薛会英.利用高通量测序法对模拟增温条件下藏北高寒草甸土壤线虫群落的研究[J].草地学报,2019,27(2):443-451.
[18] 温占波,李劲松.分子生物学在空气微生物气溶胶研究中的应用进展[J].微生物学免疫学进展,2007(02):69-71.
[19] 方治国,郝翠梅,姚文冲,欧阳志云.空气微生物群落解析方法:从培养到非培养[J].生态学报,2016,36(14):4244-4253.
[20] 杨清香,辛媛,李慧君,王瑞民.新乡市冬季严重雾霾下医院和校园气传微生物群落组成研究[J].河南师范大学学报(自然科学版),2020,48(04):78-88+2.